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策略探讨 | 剪接因子SRSF1如何影响全身性红斑狼疮的T细胞过度活跃
发布时间:2019-11-08 15:02:48   资讯来源:JCI, 2019

福福建快三开奖结果直播 www.ikzyg.com 【主要看点】

通过RNA测序、荧光素酶检测、免疫印迹、qRT-PCR等实验技术,发现并验证了主要研究因子SRSF1可促进PTEN的表达,从而抑制mTORC1信号通路的激活,最终对T细胞的过度活跃产生影响。

 

【参考来源】

JCI, 2019, Splicing factor SRSF1 controls T cell hyperactivity and systemic autoimmunity

Fig.4 T cells from Srsf1-cKO mice exhibit increased activation of the mTORC1 pathway and reduced expression of PTEN.

 

【关键知识】

mTOR信号通路:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶,存在于两个不同的复合体中。第一个为mTOR复合体1mTORC1),由mTOR、Raptor、GβLDEPTOR构成;第二种复合体是mTOR复合体2mTORC2),由mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1DEPTOR构成。mTOR信号转导异常见于多种疾病,如癌症、心血管疾病和糖尿病。

PTEN具有磷酸酯酶的活性,可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性,可抑制肿瘤的发生发展。

3’-UTR荧光素酶检测:将研究基因mRNA3’-UTR插入带有荧光素酶报告基因的载体中,其后进行相关刺激,通过检测荧光强度观察不同刺激手段下对荧光素酶表达的影响,从而可测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响。

 

【结果展示】

Step 1流式分选Srsf1-cKO 小鼠、野生型小鼠的T细胞,其后分别进行RNA测序,分析各关键通路因子的表达差异。

实验结果显示,Srsf1基因被敲除后,T细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的几个关键因子均有不同程度的影响;其中,该通路的抑制因子PTEN的表达明显下调。


Step 2通过Western Blot,检测mTOR信号通路中关键活化因子的磷酸化情况,确定在Srsf1-cKO 小鼠T细胞中mTOR信号通路的激活情况。

实验结果显示,Srsf1基因被敲除的小鼠T细胞中,S6、AKT在自身表达情况无明显变化的情况下,其磷酸化情况明显上升,即Srsf1敲除后增加了mTOR信号通路的激活。

Step 3为进一步确定在Srsf1-cKO 小鼠T细胞中PTEN表达下调的原因,通过qRT-PCR、Western Blot在其mRNA及蛋白水平上进行验证。

实验结果显示,Srsf1-cKO 小鼠T细胞中PTEN的mRNA、蛋白表达均有明显的下调。

Step 4由于之前已有报道显示SRSF1一般是通过与下游基因3’-UTR结合,在转录后调控水平上影响基因的表达,故在此选择进行3’-UTR荧光素酶检测,确定SRSF1调控PTEN表达水平的机制。

实验结果显示,SRSF1主要作用于Pten mRNA 3’-UTR,从而影响PTEN蛋白的表达;SRSF1的过表达可促进PTEN的表达,SRSF1的被敲除后PTEN的表达明显被抑制,且在SRSF1回复后PTEN的表达也随之回复。


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